唐琳懿^1,2，靳春平¹，唐江²，李峻峰²，刘达玉¹，邹强^1*

（1.成都大学食品与生物工程学院，四川成都 610106；2.安岳县柠檬科学技术研究所，四川资阳 641300）

关键词：柠檬；甘蔗；果酒；混菌发酵

Optimization of Fermentation Condition for Mixed Bacteria of Lemon-cane Wine

TANG Linyi^1,2, JIN Chunping¹, TANG Jiang², LI Junfeng², LIU Dayu¹, ZOU Qiang^1*

(1.College of Food and Biological Engineering, Chengdu University, Chengdu Sichuan 610106, China;

2.Anyue Lemon Science and Technology Institute, Ziyang Sichuan 641300, China)

Abstract: In order to improve the flavor and taste of the mixed fermented fruit wine of lemon and sugar cane, the effect of mixed inoculation fermentation of aroma-producing active yeast and alcohol active dry yeast for fruit wine on mixed fruit wine of lemon and sugar cane was studied. The results determined that the optimal process conditions for mixed bacteria inoculation for fermenting lemon and sugarcane wine were as follows: inoculation of aroma-producing active yeast 12 hours in advance, the inoculation amount of mixed bacteria was 0.7g/L,and the inoculation ratio of aroma-producing active yeast and alcohol active dry yeast for fruit wine was 1:6(m/m),lemon juice and sugar cane juice in a mixing ratio of 1:2(v/v).Under this condition, the alcohol content of lemon and sugar cane wine is 12.1%vol,and the sensory score is 87.This study provides a theoretical basis for the mixed fermentation of lemon and sugarcane wine.

Key words: lemon; sugar cane; fruit wine; mixed cultivation

柠檬富含柠檬酸、类黄酮、维生素C、维生素A及Ga、Fe等矿物质，具有清除自由基、降低胆固醇、预防坏血病等多种功效^[1]。我国柠檬产量为8~10万t，但加工产业起步较晚，仅20%的柠檬被用于加工^[2]，而用柠檬酿酒能保留柠檬的特殊香味^[3]，是柠檬加工的重要途径。

柠檬汁含酸量较高，为5%左右，含糖量仅为7%左右，仅使用柠檬汁酿造果酒，酵母很难存活，通常需要通过添加糖或粮食搭配降酸。目前国内普遍利用商品化的单一酵母菌株发酵生产柠檬果酒，但利用该方法生产得到的柠檬果酒存在柠檬果香味严重不足，口感淡薄的问题。近年来，越来越多的研究利用非酿酒酵母和酿酒酵母对果酒进行混合发酵，通过混合发酵可有效提高果酒酒体色泽，增加果酒挥发性香气成分^[4-6]。因此，本试验将果酒专用酵母和生香酵母共同接种于柠檬和甘蔗混合汁中进行发酵，通过单因素和正交试验确定柠檬甘蔗果酒发酵*适条件，以期为柠檬甘蔗果酒的混菌发酵提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜且充分成熟的尤力克柠檬、新鲜无霉烂的云南罗汉甘蔗，市售；果酒专用酵母（SW）、生香活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；偏重亚硫酸钾、果胶酶（50000U/g），成都欣欣食品添加剂有限公司；白砂糖，云南滇鹏糖业有限公司。

1.2 仪器与设备

BY111-0-100酒精计，东方化玻（北京）科技有限公司；SHP-80生化培养箱，常州普天仪器制造有限公司；JA2003N电子天平，上海佑科仪器仪表有限公司；HH-6水浴锅，上海胜卫电子科技有限公司；YT-9002多功能榨汁机，南京满森餐饮设备有限公司。

1.3 试验方法

参照刘达玉等^[7]方法。

1.3.1 柠檬甘蔗果酒酿造工艺流程

添加偏重亚硫酸钾、果胶酶

↓

柠檬和甘蔗预处理（清洗、去皮榨汁、汁渣分离、加糖调配）→柠檬汁和甘蔗汁混合→酶解→灭酶→发酵→静置澄清→陈酿→品评  

1.3.2 柠檬甘蔗果酒酿造操作要点

（1）调配后含糖量为12%的柠檬汁与调配后含糖量为26%的甘蔗汁按试验比例混合成1.5L，然后在混合汁中添加1‰偏重亚硫酸钾对其进行防腐处理，接着添加果胶酶0.5mg/kg，45℃保温90min后升温至90℃并维持5min以灭酶；

（2）取上述柠檬汁、甘蔗汁的混合汁按试验顺序分别接种果酒专用酵母和生香活性干酵母，扎紧封闭缸口在25℃下发酵5d；

（3）发酵结束后取上清液，于（10±2）℃避光陈酿一个月，取样待测。

1.3.3 柠檬甘蔗果酒工艺优化单因素试验

1.3.3.1 接种方式对柠檬甘蔗果酒的影响

在接种量0.8g/L、生香活性干酵母与果酒专用酵母接种比例1:5（m/m）、柠檬汁与甘蔗汁混合比例1:2（v/v）的条件下，将生香活性干酵母提前24h接种、生香活性干酵母提前12h接种、生香活性干酵母与果酒专用酵母同时接种、果酒专用酵母提前24h接种、果酒专用酵母提前12h接种柠檬甘蔗混合果汁，25℃发酵5d。

1.3.3.2 接种量对柠檬甘蔗果酒的影响

在生香活性干酵母与果酒专用酵母接种比例1:5（m/m）、柠檬汁与甘蔗汁混合比例1:2（v/v）、生香活性干酵母提前12h接种的条件下，调整不同酵母接种量0.5、0.6、0.7、0.8、0.9g/L接种柠檬甘蔗混合果汁，25℃发酵5d。

1.3.3.3 接种比例对柠檬甘蔗果酒的影响

在接种量0.8g/L、柠檬汁与甘蔗汁混合比例1:2（v/v）、生香活性干酵母提前12h接种的条件下，调整生香活性干酵母与果酒专用酵母接种比例分别为1:4、1:5、1:6、1:7、1:8（m/m）接种柠檬甘蔗混合果汁，25℃发酵5d。

1.3.3.4 混合比例对柠檬甘蔗果酒的影响

在接种量0.8g/L、生香活性干酵母与果酒专用酵母接种比例1:5（m/m）、生香活性干酵母提前12h接种的条件下，调整柠檬汁与甘蔗汁混合比例1:1、1:2、1:3、1:4、1:5（v/v），25℃发酵5d。

1.3.4 柠檬甘蔗果酒工艺优化正交试验

在单因素试验的基础上，挑选对果酒影响较大的因素设计正交试验方案，进行综合研究分析，并对酒精度*条件组合和感官评分*条件组合分别进行3次平行验证试验，计算酒精度和感官评分平均值，确定*工艺条件。正交试验因素与水平见表1。

表1 正交试验因素与水平

Tab.1 Orthogonal experimental factors and levels

1.3.5 柠檬甘蔗果酒酒精度测定

酒精度采用GB 5009.225—2016《食品安全国家标准 酒中乙醇浓度的测定》中第二法酒精计法测定^[8]。

1.3.6 柠檬甘蔗果酒感官评定

由10人组成的感官评定小组对柠檬甘蔗果酒的色泽、香气、口感三方面进行感官评分。评分标准见表2。

表2 感官评分标准

Tab.2 Sensory scoring criteria

2 结果与分析

2.1 不同接种方式对柠檬甘蔗果酒发酵效果的影响

    如图1所示，生香活性干酵母提前接种有利于提升柠檬甘蔗果酒的感官评分，但不利于提升酒精度。有研究表明，非酿酒酵母能够显著提高果酒中酯、醛、酮等风味成分的含量^[9]，但两种菌同时接种或生香活性干酵母后接种，感官评分均明显降低，这可能是因为果酒专用酵母在发酵过程中成为了优势菌，不利于生香活性干酵母的代谢活动。当生香活性干酵母提前12h接种时，感官评分*，故试验选取生香活性干酵母提前24h、12h和与果酒专用酵母同时接种进行正交试验。

图1 不同接种方式对柠檬甘蔗果酒发酵效果的影响

Fig.1 Effects of different inoculation methods on the fermentation effect of lemon sugarcane wine

2.2 混菌接种量对柠檬甘蔗果酒发酵效果的影响

如图2所示，接种量在0.5~0.7g/L范围内，增加混菌接种量有利于提升柠檬甘蔗果酒酒精浓度及感官评分，接种量在0.7~0.9g/L范围内，随着接种量的增加，柠檬甘蔗果酒酒精度及感官评分呈先降低后上升的趋势。总体而言，接种量在0.5~0.9g/L范围内，增加混菌接种量对提升柠檬甘蔗果酒酒精度和感官评分具有有益影响，故试验选取混合菌接种量0.7、0.8、0.9g/L进行正交试验。

图2混菌接种量对柠檬甘蔗果酒发酵效果的影响

Fig.2 Effects of mixed bacterial inoculum on the fermentation effect of lemon sugar cane wine

2.3 不同混菌接种比例对柠檬甘蔗果酒发酵效果的影响

非酿酒酵母具备较为丰富的胞外酶，有利于水解产生大量的香味物质前体，对提高发酵酒香味的复杂程度起到重要的作用^[10]。由于非酿酒酵母对酒精的耐受浓度较低，故在发酵中后期由于不适应高浓度酒精环境而逐渐败亡。如图3所示，在相同接种量下，生香活性干酵母与果酒专用酵母接种比例1:4至1:6（m/m）范围内，增加混菌中果酒专用酵母比例，对柠檬甘蔗果酒的酒精度及感官评分产生有益影响，当生香活性干酵母与果酒专用酵母接种比例超过1:6（m/m）时，随着混菌比例的增加，柠檬甘蔗果酒酒精度不断上升，果酒感官评分降低，这可能是由于环境中酒精度过高以及过量接种酿酒酵母使其过早成为优势菌，抑制了生香活性干酵母的代谢活动。由于在混菌接种比例1:4至1:6（m/m）范围内感官评分较高，故试验选取混菌接种比例1:4、1:5、1:6（m/m）进行正交试验。

图3混菌接种比例对柠檬甘蔗果酒发酵效果的影响

Fig.3 Effects of mixed bacteria inoculation ratio on the fermentation effect of lemon sugar cane wine

2.4 混合汁比例对柠檬甘蔗果酒发酵效果的影响

如图4所示，在柠檬汁与甘蔗汁比例为1:1至1:5（v/v）范围内，随着混合汁中甘蔗汁比例的不断增加，果酒酒精度逐渐升高。但混合汁中甘蔗汁比例过高对果酒感官评分不利，当柠檬汁与甘蔗汁比例为1:2（v/v）时，柠檬甘蔗果酒的感官评分*。当柠檬汁与甘蔗汁比例超过1:2（v/v）时，随着混合汁中甘蔗汁比例的不断增加，果酒感官评分逐渐降低，这可能是由于甘蔗汁含有较高的糖含量，随着混合汁中甘蔗汁比例的不断升高，混合汁中可供酒精发酵的糖含量也随之增加，有利于酒精的发酵与积累，从而抑制了非酿酒酵母的代谢活动。由于柠檬汁与甘蔗汁比例为1:1（v/v）时，虽然感官评分较高，但酒精度*（低于7%vol），故试验选取混合汁比例1:2、1:3、1:4（v/v）进行正交试验。

图4混合汁比例对柠檬甘蔗果酒发酵效果的影响

Fig.4 Effects of mixed juice ratio on the fermentation effect of lemon cane wine

2.5 混菌发酵柠檬甘蔗果酒工艺优化正交试验与结果分析

根据单因素试验结果，选取A（生香活性干酵母接种顺序）、B（柠檬汁与甘蔗汁混合比例）、C（混菌接种量）、D（生香活性干酵母：果酒专用酵母接种比例）设计4因素3水平L₉(3⁴)正交试验，以酒精度和感官评分作为评价指标，确定*工艺组合。正交试验结果如表3所示，进一步验证试验结果如表4所示。

表3 混菌发酵正交试验结果

Tab.3 Orthogonal test results of mixed bacteria fermentation

表4 *工艺条件进一步试验结果

Tab.4 Further test results of optimal process conditions

由表3可知，影响柠檬甘蔗果酒酒精度各因素主次顺序为：B（柠檬汁与甘蔗汁混合比例）>D（生香活性干酵母：果酒专用酵母接种比例）>A（生香活性干酵母接种顺序）>C（混菌接种量），*工艺条件组合为A₃B₃C₂D₃；影响柠檬甘蔗果酒感官评分各因素主次顺序为：B（柠檬汁与甘蔗汁混合汁比例）>C（混菌接种量）>A（生香活性干酵母接种顺序）>D（生香活性干酵母：果酒专用酵母接种比例），*工艺条件组合为A₂B₁C₁D₃。

将此两组试验进行验证，如表4所示，在A₂B₁C₁D₃条件下，柠檬甘蔗果酒的酒精度为12.1%vol，感官评分为87分；在A₃B₃C₂D₃条件下，柠檬甘蔗果酒的酒精度为13.4%vol，感官评分为72分，由于两条件下酒精度均较高，而A₂B₁C₁D₃拥有更高的感官评分，故A₂B₁C₁D₃为*工艺条件组合。

3 结论

本研究利用单因素试验与正交试验得到生香活性干酵母与果酒专用酵母混合发酵柠檬甘蔗果酒的*工艺参数：生香活性干酵母提前12h接种、混菌接种量0.7g/L、生香活性干酵母与果酒专用酵母接种比例1:6（m/m）、柠檬汁和甘蔗汁混合比例1:2（v/v），在此条件下，柠檬甘蔗果酒的酒精度为12.1%vol，感官评分为87分。

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